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单细胞测序分析卵裂期优质胚胎染色体情况研究

时间:2019-06-04 05:22来源:未知 作者:admin 点击:
目前体外受精-胚胎移植( in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET) 迅速发展,临床上主要通过受精 原核评分( 如原核核仁的大小、数目和分布情况) 及胚 胎形态学评分( 如胚胎的发育速度

  目前体外受精-胚胎移植( in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET) 迅速发展,临床上主要通过受精 原核评分( 如原核核仁的大小、数目和分布情况) 及胚 胎形态学评分( 如胚胎的发育速度、卵裂球的均一度、 胚胎碎片数量) 选择胚胎进行移植,但是卵裂期胚胎 植入率仍仅有 26. 7%[1]~27. 32%[2]。而且,不孕症患 者在行辅助生殖技术助孕后早期流产率约为 14. 8% [1] ~16. 77% [2],其中,高达 65. 2%[3]由染色体 异常导致。这些数据提示早期优质胚胎中可能存在 较高的染色体异常。但是,目前对于卵裂期优质胚胎 中染色体异常情况及其对胚胎发育的影响尚不明确, 本研究应用多次退火环状循环扩增( multiple annealing and looping-based amplification cycles,MALBAC) 单细胞测序对卵裂期优质胚胎染色体情况进行分析。

  1. 1 实验材料 选取 2011 年 1 月至 2015 年 12 月在 广西医科大学第三附属医院因男方因素行卵胞浆内单精子显微注射( intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 治疗并已生育健康婴儿的夫妇捐献的 19 枚优质 卵裂期冷冻胚胎。冷冻胚胎符合以下标准: ①均源于 当个成功 ICSI 周期剩余冷冻胚胎; ②均为正常受精后 16~18 小时的 2 个原核( 2 PN) ,第 2 天卵裂球数数目 为 2~5 个,第 3 天卵裂球数目为 6~10 个的Ⅰ级或Ⅱ 级优质胚胎。本研究经伦理委员会讨论通过,患者均 已签署知情同意书。

  1. 2. 1 卵裂球的收集 将胚胎移至蛋白酶小滴中, 透明带完全溶解后,将胚胎移至含 10%蛋白的无 Ca2+、 Mg2+磷酸盐缓冲溶液( D-PBS) 小液滴中 2 分钟, 用吸管轻轻吹打使卵裂球分散,然后用吸管分别将卵 裂球放入磷酸盐缓冲溶液( PBS) 液滴中洗涤,装入含 有 5 μl 裂解液的离心管中。放入-20℃冷冻保存待 用。

  1. 2. 2 全基因组扩增 按 MALBAC 全基因组扩增试 剂盒( 亿康公司,上海) 说明将放入裂解液中的卵裂球 进行扩增; 按磁珠法 DNA 纯化回收试剂盒( 亿康公 司,上海) 说明,对扩增产物进行纯化,然后上机进行 DNA 片段的打断。

  共获得 7 对夫妇捐献的优质卵裂期冷冻胚胎 19 枚。解冻 19 枚胚胎,复苏率为 100%,共收集卵裂球 95 个; 92 个卵裂球获得测序结果,获结果率为 96. 8%。 2. 1 19 枚优质胚胎染色体情况 4 枚为正常的二倍 体胚胎,占 21. 1%; 15 枚为异常胚胎,占 78. 9%,其中 非嵌合型异常胚胎 1 枚( 5. 3%) ,嵌合型异常胚胎14 枚( 73. 7%) ,包括 4 枚二倍体嵌合型异常胚胎 4 枚 ( 21. 1%) ,异常嵌合型异常胚胎 6 枚( 31. 6%) ,无规 律分离型异常胚胎4 枚( 21. 1%) 。 2. 2 92 个卵裂球的染色体情况 92 个卵裂球得到 明确的测序结果。正常二倍体卵裂球 43 个,占 46. 7%;染色体异常卵裂球49 个,占 53. 3%,其中 37 个( 40. 2%) 卵裂球存在染色体数目异常 ; 26 个 ( 28. 2%) 卵裂球存在染色体结构异常; 14 个( 15. 2%) 卵裂球存在染色体数目合并结构异常。

  目前辅助生殖技术主要是以受精原核及胚胎形 态学分析的方法来选择优质胚胎进行移植,但是,这 并不能排除染色体异常的胚胎。在过去十余年,荧光 原位杂交技术( fluorescence in situ hybridization, FISH) 是染色体的主要检测方法,我国学者也做了大量研究 工作, 2012 年郝燕等[5]报道应用 5 色探针探讨卵裂期 胚胎发育与染色体异常之间的关系。2013 年史秋雯 等[6]报道应用 11 色探针检测植入前胚胎非整倍体的 研究。基于技术的限制, FISH 只能对有限的染色体进 行检测。随着高通量测序技术的发展,Wells 等[7]应 用比较基因组杂交技术( comparative genomic hybridization, CGH) 对卵裂期优质胚胎卵裂球进行分析。 Keskintepe 等[8]应用比较基因组杂交-微阵列技术 ( array-based comparative genomic hybridization,array CGH) 对卵裂期胚胎进行分析。然而,目前使用 MALBAC 单细胞测序对卵裂期胚胎中的整体染色体情况 进行分析的研究较少。本研究使用 MALBAC 单细胞 测序技术,对 19 个卵裂期优质胚胎中的 95 个卵裂球 进行研究,其中, 92 个卵裂球获得测序结果,获得结果 率高达 96. 8%。 根据 Delhanty 等[4]制定的胚胎分类标准,本研究 中的 19 枚胚胎,正常胚胎 4 枚,占 21. 1%; 异常胚胎 15 枚,占 78. 9%,主要为嵌合型异常胚胎 14 枚,占 73. 7%,其中二倍体嵌合型异常胚胎为 4 枚,占 21. 1%,异常嵌合型胚胎为 6 枚,占 31. 6%。2011 年 一篇 Meta 分析[9]数据结果示: 在 815 枚胚胎中, 177 枚是二倍体胚胎,占 22%; 599 个是嵌合型胚胎,占 73%;在嵌合型胚胎中,有 480 个是二倍体嵌合型胚 胎, 占 59%。这篇 Meta 分析大部分研究采用 FISH 方 法进行检测。本研究与 Meta 分析中的正常二倍体胚 胎率是基本相似的,但其二倍体嵌合型异常胚胎率较 Meta 分析中的低,这可能与本研究使用 MALBAC 单 细胞测序技术,对 24 条染色体进行全面的分析,发现 更多的染色体异常有关。 本研究中,使用单细胞测序对 19 枚胚胎的 92 个 卵裂球进行分析,正常二倍体卵裂球 43 个,占 46. 7%。异常卵裂球 49 个,占 53. 3%。Judy 等[10]使 用 arrayCGH 对优质卵裂期胚胎的多数卵裂球进行检 测,发现正常卵裂球占 48. 9%。Mertzanidou 等[11]的 研究也得到相类似的结果,早期胚胎中正常二倍体卵 裂球为 55. 7%。本研究结果显示: 在优质卵裂期胚胎 中, 53. 3%卵裂球存在染色体异常,这与胚胎染色体异 常率相差较大,考虑是由于嵌合体现象导致的,提示 活检卵裂球行植入遗传学诊断/植入遗传学筛查 ( PGD/PGS) 存在较高的误诊的风险。

  通过高通量测序对 24 条染色体进行检测发现, 在胚胎中存在染色体结构异常,但是对于结构异常的 发生率是存在争议的。本研究发现 28. 2%的卵裂球 存在染色体结构异常。Daphnis 等[12]使用 CGH 报道 了 12. 8%的卵裂球存在染色体结构畸变; Vanneste 等[13]使用单核苷酸多态性微阵列技术( array-based Single Nucleotide Polymorphism, array SNP) 报道了在胚 胎中染色体结构畸变率 31%。但是,对于染色体结构 异常发生的起源及生物学意义尚不明确。 本研究中,二倍体胚胎 4 枚,占 21. 1%,低于目前 的卵裂期胚胎的种植率 26. 7%[1] ~ 27. 32%[2]。李 静[14]等的研究表明,胚胎解冻后少量卵裂球的损伤对 妊娠结局没有明显影响,这考虑是因为早期胚胎中, 并非所有卵裂球都是胚胎生长发育的必需。这提示 存在部分异常卵裂球的胚胎仍具有发育为正常胚胎 的潜能。造成上述结果的原因可能有以下几种: 第 一,卵母细胞转录机制的限制导致了细胞周期调控的 不足及胚胎基因的不完全激活,从而导致了早期胚胎 的高嵌合性的发生[15],但是,当胚胎发育至 8 细胞阶 段,胚胎基因激活,启动了细胞循环基因,减少胚胎后 续发展阶段异常细胞的比例; 第二,在胚胎发育过程 中,正常二倍体细胞持续增长,而非整倍体细胞可能 会自行凋亡[16];第三,非整倍体卵裂球也有可能是通 过染色体不分离或者后期滞后这些自我修复机制,更 甚者非整倍体卵裂球在胚胎发育过程中自行远离中 心内细胞团,从而获得正常胎儿的活产[17]。

  综述所述,通过应用单细胞测序对优质卵裂期胚 胎的染色体情况分析发现,卵裂期胚胎中存在较高的 染色体异常,可能是影响胚胎种植率的重要因素之 一。然而,对于染色体异常形成的来源、分子机制及 对胚胎发育潜能的影响仍尚不明确,这是今后工作中 需继续探究的方向。

  来源:黎霓娜,史秋雯,许常龙,李春苑等,单细胞测序分析卵裂期优质胚胎染色体情况研究 [J],实用妇产科杂志,2018,34(8):635-638.

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